郭晓兰教授邀你认知核酸检测
核酸检测可谓是最近的热搜词汇，那到底什么是核酸检测呢？今天我校郭晓兰教授就来告诉大家新型冠状病毒之下的核酸检测。
郭晓兰
留美博士后，教授，硕导，川北医学院转化医学研究中心副主任（主持工作），附属医院检验科主任。全国卫生计生系统先进工作者，四川省有突出贡献的优秀专家。先后于美国德克萨斯大学M. D. Anderson 癌症中心和美国明尼苏达大学Hormel研究院作博士和博士后研究工作。
参研与承担国家自然科学基金、四川省科技厅、四川省教育厅、四川省卫计委和南充市卫计局等科研课题10余项，在Nature、EMBO J、中华肝脏病杂志、中华遗传学杂志、中华肿瘤杂志等国际、国内一流学术期刊上发表研究论文80余篇，其中SCI收录近20篇；作为课题负责人和主要完成人先后获得美国癌症研究协会（AACR）WICR学者奖、中国产学研合作创新成果奖，四川省科技进步奖、四川省医学会科技进步奖和南充市科技进步奖多项。
新型冠状病毒是什么？
在地球上，四通八达的道路，鳞次栉比的楼宇，还有山川河流、花草虫鱼，等等这一切构成了目前我们人眼所认知的宏观世界。而如果将微观世界放大一万倍乃至十万倍，那在我们眼中呈现的将是一个完全不同的“新世界”，生活在这个世界的“土著居民”我们称之为病毒。
像我们人类以肤色分为了不同颜色人种，病毒也有种类之分，其主要分为DNA病毒和RNA病毒。DNA病毒需要突破层层防线最终进入到生物细胞核，然后将自身的遗传物质偷摸地与生物DNA结合，并随之进行转录。而RNA病毒则不需要进入到细胞核，它们只要潜入到细胞中就达到了目的，因为它们可以仿照生物体内的信使RNA来指导自身所需的蛋白酶和几种结构蛋白质进行转录。比如2019年出现的新型冠状病毒就属于RNA病毒，这也是所有RNA病毒中最大的一种，这个家族成员还包括著名的SARS病毒、MERS病毒等，它们都属于冠状病毒。
著名期刊《柳叶刀》上发布了2019新型冠状病毒的电镜高清照片，看上去有点滑腻，表面还有许多圆柱形的突起，其实这也是冠状病毒的名称由来，看上去像是一个个小皇冠。
不过，除了这种电镜直出的伪彩色照片之外，还有人通过彩绘将电镜下的病毒画了出来，比如下面这幅冠状病毒的插画。
这幅图描绘了冠状病毒刚进入肺泡时的情况，在它的周围有呼吸细胞分泌的黏液、抗体和几种小型的免疫系统蛋白。而病毒则被一圈膜给包裹着，该膜包含S（spike）蛋白、M（membrane）蛋白、E（envelope）蛋白和N（nucleocapsid）蛋白。其中S蛋白也叫刺突，主要是为了粘附在细胞膜表面并帮助病毒进入到细胞内部；M蛋白是病毒进入细胞后的又一层伪装，它可以参与内部核蛋白的组织；E蛋白是一个与病毒出芽有关的膜通道；在病毒的内部包含着许多拷贝的N蛋白，它们与冠状病毒的基因组RNA所结合。
（对应位置如下图）
新冠病毒的核酸检测
自新冠疫情爆发以来，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起新型冠状病毒肺炎（COVID-19）受到全球关注，其传染性强、传播速度快，目前其感染病例已在世界范围内急剧增加，尤其是美国、西班牙、意大利等，世界卫生组织于2020年3月12日宣布此次由SARS-CoV-2 病毒引起的 COVID-19 已具有全球大流行特征。COVID-19 患者的早发现、早隔离是疫情控制最有效的方法，而作为 COVID-19 感染确诊“金标准”的核酸检测是疾病早期发现的基础。新冠检测，以及与之相关的话题，成为社会关注的热点。截至目前，新冠肺炎没有特效药，但不乏针对性检测产品。例如，核酸检测，一种在临床检验实验室也不算常用的检测方法，一时间妇孺皆知——尽管绝大多数人不知道核酸检测究竟是检测核糖核酸还是检测脱氧核糖核酸，甚至不知道什么是核酸。下面就新冠核酸检测相关知识作一简单介绍。
No.1
核酸检测技术及原理
SARS-CoV-2 属于β属冠状病毒，其遗传物质是单条正义 RNA 链。SARS-CoV-2核酸检测也就是SARS-CoV-2RNA检测，在患者标本中检测是否有SARS-CoV-2RNA的存在来判断被检测个体是否感染SARS-CoV-2。目前SARS-CoV-2核酸检测主要有两种方法,一种是基因测序,一种是实时荧光定量PCR。在疫情初期，面对新的病原体，最先检出SARS-CoV-2是高通量测序技术，并通过此技术确定了SARS-CoV-2 核酸序列，但这种技术成本高、耗时长、对仪器和操作人员要求高、不能满足疫情暴发大规模标本检测的需求。针对 SARS-CoV-2 核酸的检测，当前最为普遍适用的技术方法是实时荧光定量PCR，可高效、快速地完成病毒样本的检测，成为国家卫健委《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》中首推的检测方法。
实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一项技术。PCR即聚合酶链反应，是一种在人体外模拟人体细胞内DNA扩增的技术，用于放大扩增特定的DNA片段。实时荧光定量PCR通过在PCR反应体系中加入荧光基团，标记跟踪PCR产物进行实时监测，利用与之相适应的软件对产物进行分析，来达到定量的目的。在SARS-CoV-2核酸检测中，由于SARS-CoV-2是 RNA病毒，RNA结构不稳定，需要先把它转化成DNA，才能进行PCR，由RNA转换成DNA的过程称之为逆转录。逆转录之后，我们以SARS-CoV-2独特的基因序列为检测靶标，通过PCR扩增，使选择的这段靶标DNA序列指数级增加，每一个扩增出来的目的DNA序列，都可与我们预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，扩增出来的靶基因越多，累积的荧光信号就越强。而没有病毒的样本中就检测不到荧光信号增强。通过检测荧光信号累积是否增强就可以确定样本中是否有SARS-CoV-2核酸。
根据已发布的SARS-CoV-2全基因组序列，发现基因组水平上其与多种冠状病毒的同源性高达80%以上，因此应选择特异性区域进行核酸检测。目前新冠病毒核酸检测针对的位点主要包含病毒基因组中3段保守基因序列，即开放性读码框 ORF1ab、N 基因和E 基因，也有少数商品试剂盒同时检测刺突糖蛋白（S）基因。根据新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南，实验室针对新冠病毒的核酸检测应至少包含最为保守及特异的ORF1ab区域以及N基因。在实验室要确认一个病例为阳性，需满足同一份标本中新冠病毒的ORF1ab及N基因 2个靶标特异性PCR检测结果均为阳性，或单靶标阳性患者重新采样/另一类型样本检测仍为单靶标阳性。
No.2
核酸检测样本类型及检出情况
目前在鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便、尿等标本中均可检测出SARS-CoV-2。不同检测部位的病毒含量不尽相同，从而会导致核酸检测阳性率有不同程度差异，下呼吸道标本检出率高于上呼吸道标本检出率，对于已有症状及肺部CT改变的患者来说，下呼吸道样本为核酸检测首选。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》也提到了下呼吸道标本检测具有更高的准确性。但临床上由于多数患者咳痰困难，取下呼吸道灌洗液样本操作的生物安全风险极大，故呼吸道样本以鼻咽拭子及咽拭子为主。一般情况下，不同样本类型SARS-CoV-2核酸检出率排序为：支气管肺泡灌洗液（BALF）>抽吸痰或咳痰>鼻咽拭子或口咽拭子>鼻拭子。另外，很多专家从大量的临床实践工作中得出经验认为鼻咽拭子标本阳性率要高于口咽拭子标本。根据《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（第四版）》，每个病例必须采集急性期呼吸道标本（包括上呼吸道标本和下呼吸道标本）；重症病例优先采集下呼吸道标本（如支气管或肺泡灌洗液等）；出现眼部感染症状的病例，需采集眼结膜拭子标本；出现腹泻症状的病例，需留取便标本。可根据临床表现与采样时间间隔进行采集。
鼻咽拭子是SARS-CoV-2核酸检测最为常见的标本类型，但鼻咽拭子核酸阳性检出率相对较低，阳性检出率仅为30％～50％，标本的正确采集及保存对后续的检测至关重要。对于鼻咽拭子，要选取植绒拭子采样，而不能选取棉签拭子采样。棉签拭子采样会影响上皮细胞的洗脱和核酸的提取，普通棉签拭子的核酸检出率会明显低于带病毒保存液的植绒拭子。咽拭子样本应在咽峡深部（悬雍垂及扁桃体两侧）利用植绒拭子反复刮取获得，鼻拭子样本应在鼻腔深部利用植绒拭子反复刮取获得，若未在正确部位采集，将不能获取合格的上皮细胞。采样后，植绒拭子应置于细胞保存液/生理盐水中保存并及时送检：拭子干燥后会影响核酸的提取。
No.3
核酸检测“假阴性”问题
目前，全国各地多家医疗机构均出现过SARS-CoV-2核酸检测“假阴性”的案例，临床症状及影像学高度疑似病毒性肺炎，但新型冠状病毒核酸检测多次或始终为阴性。针对这种“假阴性”的影响因素可能有以下几个方面：1.病毒变异可能:SARS-CoV-2是不稳定RNA 病毒，容易在传播过程中发生变异，目前对新冠病毒的研究尚浅，是否存在进化上的保守区域的突变还未可知，核酸检测试剂也缺乏大规模的临床验证，若是病毒 RNA 的引物设计区域发生突变，可直接导致检测结果的假阴性；2.采集样本的时间、类型及方法不当:机体被病毒感染后，病毒通过鼻腔和口腔进入到咽喉部，再到气管和支气管，进而到达肺泡，感染者会经历潜伏期、轻度症状、再到严重症状的过程，不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒量有所不同，是因为这些部位细胞所含病毒受体占比不同所致。新型冠状病毒感染，肺泡上皮细胞的病毒受体表达占比最高，气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等则占比极低。因此，下呼吸道的病毒量明显高于上呼吸道。目前临床上对 SARS-CoV-2 感染后鼻、咽部采样的最佳时机尚无定论，尤其是个别病例潜伏期长，就诊时可能已经迁延数天甚至数周，是否为鼻、咽部采样的最佳时期无法确定。且鼻咽拭子采集方法具有先天的局限性，随机性较高，标本内病毒载量是否仍在检测阈值范围内均无法确定，可能产生假阴性结果。3.试剂因素：由于疫情形势的严重性和紧迫性，部分厂家的试剂产品 由于试剂厂家研发时间短，也没有使用已知临床样本进行必要的性能确认，可能存在对试剂优化不充分以及试剂批间差异大等问题，不可避免地存在部分产品的有效性难以保证。4.其他因素：扩增仪孔间温度差异，反应体系中存在RCR抑制剂，SARS-CoV-2标本久置RNA降解，人员操作失误等。
SARS-CoV-2核酸检测是COVID-19 感染确诊的“金标准”，但而阴性结果不能排除新型冠状病毒感染。已被感染的患者有些不能检出病毒核酸，与临床表现不符，这种“假阴性”无法完全避免。临床上对于核酸检测为阴性要谨慎对待，尤其是临床症状及影像学高度疑似病毒性肺炎，应多次送检核酸检测，结合新型冠状病毒特异抗体检测，协助诊断。
目前各方判断，新冠病毒有可能成为类似流感病毒一样和人类长期共存的病毒，而不会像十七年前的SARS一样突然销声匿迹。研发和改进新冠检测相关产品，满足临床和社会的需求——又快、又准、又简便、又便宜——是一项艰巨的任务；检测很重要，但检测也不是万能的。试剂也有局限性，需要思考怎么科学地利用科学的成果——这是疫情防控的一个重要环节，但不会是一劳永逸的护身符。
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编辑/排版：李海平
责任编辑：曾书娟
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